MYCOBACTERİUM

1. Tübercülosis
2. Bovis
3. Africanum tüberküloz etkenleridir

Kapsülsüz, hareketsiz, aerob, %5-10 CO2 de daha iyi ürer, yavaş ürer, 4-6 haftada ürer.

MYCOBAKTERİ BESİYERLERİ
NON SELEKTİF	NON SELEKTİF
LOWENSTEİN JENSEN YUMURTA + GİSEROL + PATATES İNHİBİTÖR : MALAŞİT YEŞİLİ	SELEKTİF LOWENSTEİN JENSEN ( Lowenstein Jensene ilave olarak ) + NALİDİKSİK ASİT + RNA YADA NALİDİKSİK ASİT + SİKLOHEKSİMİD
PETRAGNANİ by YUMURTA+ GLİSEROL+ PATATES+ SÜT İNHİBİTÖR : MALAŞİT YEŞİLİ
TRUDO YUMURTA SARISI + GLİSEROL + PATATES İNHİBİTÖR : MALAŞİT YEŞİLİ
MİDDLEBROOK DEXTROZ+ ALBUMİN+GLİSEROL+KATALAZS İNHİBİTÖR: MALAŞİT YEŞİLİ	SELEKTİF MİDDLEBROOK ( Middlebrook a ilave olarak ) LİNKOMİSİN+NALİDİKSİK ASİT VEYA POLİMİKSİN B+ AMPHOTERİCİN B içerir.

 

MYCOBACTERİUM TÜBERCÜLOZİS:

• Sıvı besiyerinde yüzeyde 3 haftada zar yapar.
• Katı BY de daha çabuk ürer (ögonik üreme) 2-3 haftada ürer.
• Gliserin üremesini hızlandırır. ( gliserin M. Bovis in üremesini yavaşlatır).
• Siğil benzeri kirli beyaz koloniler yapar. Sarı pigment yapar.

MYCOBACTERİUM BOVİS:

• Katı BY de sıvıdan daha yavaş ürer. ( disgonik üreme) 4-8 haftada ürer.
• Gliserin üremesini zorlaştırır. Yuvarlak düzgün beyazsımsı koloniler yapar. Pigment yapmaz.

MYCOBACTERİUM AFRİCANUM:

• M. Tbc benzer mat koloniler yapar.
• Kobaylar hem M. Tbc hem M. bovise, tavşanlar sadece M. bovise duyarlıdır.
• Kobaya deri altı verilirse : 1 hf – 10 gün sonra yerel ülserasyon, 15. Gün bölgesel LAP, lenfojen yolla yayılan basiller hayvanı 6-15. Haftada generalize tbc den öldürür. Lenf ganglionları, Dalak, Karaciğer de darı tanesi gibi tüberkülomlar görülür. Akciğerde ki lezyonlar hafiftir. Böbreklerde hiç lezyon görülmez.
• Tavşana verilen M. Bovis ise yine generalize tbc yapar. Daha çok akciğer ve böbreklerde tüberküller görülür.
• Balgam : sabah balgamı değerlidir, tükrükle karışmadan alınmalıdır.
• lab örnekleri:
  • Mide suyu: özellikle çocuklarda tüberküloz teşhisinde kullanılır. Mide 200 ml SF ile yıkanır alınan sıvı değerlendirilir.
  • İdrar: sabah idrarı değerlidir.
  • Vücut sıvıları: pıhtılaşma ihtimali varsa %20 Na sitrat veya oxzalat katılır.
  • BOS: santrifüje edilir. Çökelti değerlendirilir. BOS içinde örümcek ağı gelişmişse bunu incelemek tanıda önemlidir.
  • İrin ve salgı: silgiç ile alınır iyice yıkanır – ezilir öyle ekilir.
  • Boyama: ARB veya IF ak larla boyanabilir. Preparatlar alvden geçirilerek veya 65 C de 2 saat bekletilerek tespit edilmelidir.

EZN BOYAMA

• Örnek lam üzerine konır fikse edilir
• KOARBOFUXİN dökülür alttan alevle  2 dk ısıtılır, kaynatmamaya dikkat edilmelidir.
• Lam yıkanır,
• ASİT ALKOL ile dekolorize edilir,
• Duru suyla yıkanır ,
• Metilen mavisi ile 20 sn zıt boyanarak kurutulur.
• EZN boyamada mavi zeminde mycobacteriler kırmızı görülür.

KİNYON EZN BOYAMA

• LAM ÜSTÜNE ÖRNEK ALINIR KURUTULUR ALEVDEN GEÇİRİLEREK FİKSE EDİLİR,
• KİNYON KARBOFUXİN DÖKÜLÜR ISITILMAZ 3DK BEKLENİR,
• DURU SUYLA YIKANIR,
• ASİT ALKOL DEKOLORİZE EDİLİR,
• DRUU SUYLA YIKANIR,
• ZIT BOYA ( MALAŞİT YEŞİLİ ) 30 SNBEKLENİR,
• DURU SUYLA YIKANIR KUTURUTULUR İNCELENİR,
• Kinyon ARB boyama ile yeşil zeminde kırmızı görülür.

 

Doğrduan hastalık materyalinden yapılan preparatta basil görülebilmesi için 1 ml materyalde ( balgamda)100 . 000 bakteri bulunmalıdır.

ARB BOYAMANIN MİKROSKOPİK İNCELEMESİ RAPORLAMA:

İNCELEME ALANI	SONUÇ
100 DEN FAZLA ALAN DA HİÇ BASİL GÖRÜLMESDİ	NEGATİF
100 ALAN DA 1 – 9 BAKTERİ GÖRÜLDÜ	1+
10 ALANDA 1-9 BAKTERİ GÖRÜLDÜ	2+
HER ALANDA 1-9 BAKTERİ GÖRÜLDÜ	3+
HER ALANDA 10 DAN FAZLA BAKTERİ GÖRÜLDÜ	4+

FLUORESANLI BOYAMA

• LAM ÜSTÜNE ÖRNEK ALINIR KURUTULUR ALEVDEN GEÇİRİLEREK FİKSE EDİLİR,
• ÜZERİNE AURAMİN RHODAMİN DÖKÜLÜR  20 DK ODA ISISINDA BEKLETİLİR,
• DUR USUYLA YIKANIR,
• ASİT ALKOL İLE DEKOLORİZE EDİLİR,
• DURU SUYLA YIKANIR,
•  ZIT BOYA ( POTASYUM PERMANGANAT ) 20 SN KONUR ,
• DURU SUYLA YIKANIR KURUTULUR İNCELENİR:
• UV MİKROSKOPTA İNCELE ARB BAKTERİLER SARI ALTIN SARISI GÖRÜLÜR.

Sadece auramin O ile hazırlanan boyayla da boyanabilir o zaman mavi ışıkta incelenir, uv mikroskop gerekmez.

MYCOBAKTERİUM İNCELEMESİNDE HOMOJENTİZASYON, DEKONTAMİNASYON, KONSANTRASYON

• Balgam gibi homojen olmayan materyallerde az tbc basillerini görünür hale getirmek için kullanılır.
• Önce homojen hale getirilir sonra konsantre edilir.
• Homojenizasyon sırasında dekontaminasyon yapılırsa buradan kültür de yapılabilir.
• Flora içermeyenler ( BOS, Plevra sıvısı, suprapubik idrar ) dekontaminasyon gerektirmez.
• Otopsi materyalleri kontamine kabul edilir.
  • HOMOJENİZASYON:
    • NaOH ile yapılırsa final konsantrasyon %2 olmalıdır. Bunun için %4 lük NaOH solüsyonu örnek materyal  ile 1/1 oranında karıştırılır 15-30 dk oda ısısında bekletilir, 2500 devirde 15 dk santrifüj edilip çökeltiden preparat hazırlanır.
    • Diğer homojenizasyon dekontaminasyon yöntemleri:
    • Asetil sisteinli alkali yöntemi: ( asetil sistein-NaOH – trisodyumsitrat eriyiği hazırlanır) örnek 1/1 oranında karıştırılır, 30dk beklenir 2500 devirde 15 dk santrifüj edilip çökeltiden preparat hazırlanır.
    • Kültür için : homojenizasyon sonrası içine pH ayracı katılır (brom krezol blue) içine 1.25 N lik HCl katılarak nötralize edilir sonra santrifüje edilerek çökeltiden ekim yapılır.
    • Dışkı: 1 grm dışkı + 5 grm middlebrock buyyonda suspansiyon hazırlanır daha sonra balgamdaki gibi homojentizasyon ve dekontaminasyon yapılarak incelenir. Normal dışkıda M. Avium intercellulare bulunabilir.
    • Vicut sıvıları: steril koşullarda alındıktan sonra 10 ml si 100 ml middlebrock buyyona ekilir.
    • Kan: mycobacteriumlar hücre içi patojenler olduklarından pıhtılaşması engellenmiş kan 2 kat saf su ile karıştırılıp hemoliz sağlanır, santrifuje edilip ekim yapılır.
    • Mycobacteri kültürü : materyal kontamine ise selektif tbc BY ekilir, ekimleri 4-10 gün süreyle %5-10 CO2 li ortama koymak üremeyi kolaylaştırır.
    • Non selektif yumurtalı Lowenstein  Jensen besi yeri,  non selektif agarlı middlebrock besiyeri.
    • INH direnci varsa kazein hidrolizat nedeniyle INH dirençliler daha iyi ürer. M. Bovis glsierolsüz Besiyerin de daha iyi ürer.
    • Örnek çok kontamine ise selektif BY ne ekilir. Kültürler 2. 4. Günlerde incelenir. Kontaminasyon varmı diye bakılır. Haftada bir 6 hafta incelenir. 6. Haftada üreme yoksa negatif demek için bir ay daha beklenir (toplam 10 hafta).

DİĞER MYCOBACTERİ LER

WOLİNSKY /WOOD/ WASHİNGTON sınıflaması klinik sınıflamadır.

1. İnsanda patojen olan M. Tbc, M leprae
2. Fırsatçı patojenler:
   1. Avium intercellulare: m. Kansasii, m. Fortitium kompleksi
   2. M. Scrofulaceum,
   3. M. Marinum,
   4. M. Ulcerans,
   5. M. Simia,
3. Çok nadir görülenler:
   1. M. Cordona, m. Asiaticum , m. Terra  kompleksi
4. Orta hızlı üreyenler
   1. M. Flourecens
5. Çabuk üreyenler
   1. M. Smegmatis,
   2. M. Parafortitium.

RUNYON SINIFLAMASI:

Klinik mikrobiyolojik sınıflamadır 2 ye ayrılır yavaş ve hızlı üreyenler.

• YA VAŞ ÜREYENLER

  1. FOTOKROMOJENLER: ışıkta portakal sarısı karetenoid pigment yaparlar. INH+STM+PAS dirençlidir. Kobaylara patojen değildir. İv verilirse yaygın noduler nekrotik lezyon yapar.
     1. M. KANSASİİ: 1 haftada ürer,1 saat ışıkta tutulursa limon sarısı renk alır. Sürekli ışığa tutulursa turuncuya döner. İnsanda tbc benzeri akciğer enfeksiyonu yapar. Nadiren cervikal LAP osteomyelit yapar. M. Kansasii enfeksiyonları sırasında eritema nodosum ve eritema multiforme gibi aşırı duyarlılık reaksiyonları görülebilir.
     2. M. MARİNUM: 1 haftada ürer. 1 saatte limon sarısı devamlı ışıkta portakal rengi görünür. Yüzme havuzu granülomu yapar. Periferde görülür , önce mavi – mor sonra ülsere lezyon ortaya çıkar.
     3. M. SİMİAE: 1 haftada üer. Pigment için 4-6 saat beklemek gerekir. Maymunlarla ilişkisi olanlarda akciğer tüberkülozuna benzer hastalık yapar.
  2. SKOTOKROMOJENLER: hem ışıkta hem karanlıkta pigment yaparlar.
     1. 1. M.SCROFULACEUM: 1 haftada yeşil turuncu koloniler yapar. Antijenik olarak M. Avium ve M. İntercellulare ye benzer. Bu üçüne ( M. SCROFULACEUM + M. AVİUM + M. İNTERCELLULARE ) MAC KOMPLEKSİ DENİR. Çocuklarda submandibular LAP yapar.
  3. NON FOTOKROMOJENLER: karanlıkta da ışıktada pigment yapmazlar. 1 haftada ürerler.
     1. 1. 1. M. AVİUM İNTERCELLULARE: yumurtalı BY de kubbe şeklinde ve piramit şeklinde ürerler. Fırsatçı patojendirler. Tbc benzeri hastalık ve tüberküloz lenfadenopati yaparlar. AİDS de yaygın enfeksiyon yaparlar.
           2. M. ÜLCERANS: 28 – 60 günde ürerler. Transparan koloni yaparlar. Ekstremitelerde yayılmaya meyilli ülserler yaparlar.

• HIZLI ÜREYENLER ( RUNYON 4)

• 7 günden önce ürerler. Hepsi M. FORTİTİUM kompleksi olarak bira arada incelenir.
• Soyutlanan bir ARB nin 3 günde arilsülfataz ve Mc CONKEY agar deneyinin + olması M. Fortitium kompleksi tanısı koydurur.

1. M. FORTİTİUM  dallanan Flamanlı 5 günden önce tereyağı gibi ürer. Akciğer enfeksiyonu – soğuk apse yapabilir.
2. M. CLOAKA: pleomorfik, kok- çomak arası, akciğer enfeksiyonu soğuk apse yapabilir.

Mycobacterial enfeksiyon demek için:

• Hazırlayıcı faktör olmalı ( diyabet – hiv enfeksiyonu- kemoterapi – kortizon kullanımı vb. )
• Tbc- mantar ve diğer sebepler ekarte edilmeli,
• 2-3 kez aynı patojen soyutlanmalı,
• Lab işlemleri düzgün yapılmış olmalı.

MYCOBACTERİUM İDENTİFİKASYON TESTLERİ

• ISIYA BAĞLI ÜREME: Kültürden 5 adet Lowenstein Jensen besiyerie ekilir. 24-32-35-37-42 C lerde enkübe edilir. TBC ve BOVİS 35-37 C de 2 haftada ürer.
• PİGMENT OLUŞUMU: 24-30-37  C derecelerde 3 er ekim yapılır. 2 şer tanesi alüminyum folyo ile sarılır ( ışıksız) ışıklı etüve konur. Her hafta incelenir. Işıklı ortamda üreme olursa alüminyumlardan biri açılır. Oksijenlenmesi için tüp aralanır, 1-2-3 günlerde bu tüplerde pigment olup olmadığı na bakılır. 3. Gün tüm tüpler açılıp pigment oluşumu aranır.
  • Pigment yok yada zayıf pigment varsa M. Tbc,
  • Karanlıkta pigment varsa SKOTOKROMOJEN: M. SCROFULACEUM,
  • Aydınlıkta pigment varsa FOTOKROMOJEN: M. KANSASİİ – M.MARİNUM,
  • Beta karoten kristalleri varsa fotokromojen M. Kansasii –M. Marinum,
  • Pigmentsiz küçük koloniler varsa MAİS kompleksi,
  • Bazıları pigmentli bazıları pigmentsiz ise M. SMEGMATİS,
  • Malaşit yeşili BY de yeşil koloni varsa M. FORTİTİUM,

• KATALAZ: tüm mycobacteriler katalaz+ dir.
  1. Damltma yöntemi: bu yöntemle tüm mycobacteriler katalaz + dir sadece INH dirençli olan M. Tbc ve M. Kansasii katalaz – bulunurlar.
  2. Yalnız INH dirençli M. Tbc varmı diye aramakta kullanılır. Tween peroksit ile yapılır.
  3. 68 C de ısıtılmış bakterilerde katalaz testi: bu yöntemle M. Tbc, M. Bovis, M. Marinum devamlı katalaz – bulunurlar. Bunların katalazları ısıya dirençsiz ( labil ) dir.
• Mc CONKEY DE ÜREME: M. fortitium u diğerlerinden ayrırmada kullanılır. Fortitium ve M. Clonae Mc Conkey de 5 günde ürer.
• NİACİN TESTİ: M. Tbc ürediği ortama niacin salar. Sianür bromid ve anilin ilesarı renk verir.
• PYRAZİNAMİD TESTİ: pirazinamidi pirazikolik aside çeviriyormu diye bakılır.

1. M. tbc, M.Marinuum, M. Avium intercellulare pirazinamid + dir.

• %5 Na Cl de üreme : M. Smegmatis ürer.
• TELLÜRİT REDÜKSİYONU: middlebrook besiyerinde bulanıklık vermiş bakterilerden 2 damla potasyum tellürit içine damlatılır, 4 günde siyah renk alırsa + denir. M. Avium tellürit + dir.
• TİOFEN KARBOKSİLİK ASİT TESTİ ( TZH TESTİ) : M. TBC ile M. Bo vis ayrımında kullanılır. M. Bovis duyarlı, M. Tbc dirençlidir.
• TWEEN 80 TESTİ: tween 80 hidrolizine bakılır. M. Kansasii hiroliz eder + , m. Scrofula hidroliz etmez – dir.
• ÜREAZ TESTİ: örnek sıvı üre besiyerine ekilir 3 günde kırmızıya dönerse + dir. M. Tbc üreaz + M. Bovis üreaz + diğerleri negatiftir.
• NİTRAT REDÜKSİYONU : M. Tbc nitrat + m. Bovis nitrat – dir.

MYCOBAKTERİLERİN ANTİBİYOTİK DUYARLILIKLARI

Özellikle daha önce antitbc kemoterapi görmüş veya kemoterapi almaktayken 4-5 ayda balgamda hala ARB çıkartıyorsa M. Tbc ve diğer mycobacteriler için antibiyogram yapılmalıdır.

MYCOBACTERİUM LEPRA

Genellikle lepra hücresi denilen mononükleer hücreler içinde bazen dışında çalı demeti gibi veya sigara dizisi gibi kümeler şeklinde görülürler. Bu toplu görünüm ZOOGLEA denen yapışkan maddeye bağlıdır. Bu topluluklara GLOBİ denir. Besiyerinde kültürü yapıalmaz. Fare tabanına ekilirse 3-12 ayda granülom yapar. Kirpi ve armadillolarda bir yılda yaygın lepramatöz lepra yapar. Lepranın 3 klinik formu vardır:

• TÜBERKÜLOİD LEPRA : yüksek dirençli kişilerde deride daha çok gövdede eritematöz lezyonlar, hipertrofi, skleroz ile seyreden nörotik lezyonlar ve periferde sinir dejenerasyonlarına bağlı anestezik bölgeler görülür. Trofik bozukluklar ve yaralar ile seyreder.
• LEPRAMATÖZ LEPRA: direnci düşük kişilerde görülür. Granülomatöz dokulara bağlı tüm vücutta yumrular oluşur.
• BORDERLİNE LEPRA : İkisinin ortası.

LEPRA TANISI :

Tanı lezyonlarda M. Lepra basilinin görülmesiyle konur.

• Burun salgısı en uygun örnektir. ARB boyama ile lepra basili aranır. Özellikle globiler in görülmesinin büyük tanısal değeri vardır.
• Ayrıca derideki lezyonlardan kazınarak yapılan prepartın ( kaş dış kenarı vb) ARB boyasında da basil görülebilir.
• Burun kazıntısının üstüne DOPA damlatılırsa M. Lepra içeren materyal siyahlaşır.
• Son zamanlarda RİA ile antilepra antikorlarınvarlığı aranabiliyor. PCR ile de lepra dna sı bakılabiliyor.

EZN (ARB) BOYAMA = Ehrlich Ziehl Neelsen = ASİDE DİRENÇLİ BOYAMA 

Tüberküloz bakterileri gibi dış yüzeyidne mikolik asit içeren bakteriler gram boyama ile boyanamazlar bu bakteriler aside dirençlidir, EZN özellikle Mycobacteria türleri gibi asite dirençli mikroorganizmaları tanımlamak için kullanılan özel bir boyama yöntemidir

Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) boyama:

Acide Resistant Bacilli (ARB) boyama yada Acide Fast boyama yöntemi. Aside dirençli bakterilerin tespiti için kullanılan bir boyama yöntemidir. Daha çok Ziehl – Neelsen (ZN) boyama diye bilinir.
Aside dirençli bakteriler ilk boyayı öyle sıkı tutarlar ki asit alkol karışımıyla bile yıkansalar boyayı bırakmazlar ( Fast = tutma kapasitesi ).
Başta Mycobakteriler olmak üzere Actinomyces ler, Nocardia lar (N. brasiliensis ve N. Asteroides), Cryptosporodium ve Isospora gibi parazitler aside dirençli boyanırlar. Mycobakteriler lipidden zengin hücre duvarları nedeniyle aside dayanıklıdır. Asit alkol ile yapılan renk giderme de boyayı bırakmazlar.
ARB boyanan mikroorganizmalar

 Mycobacterium spp: Aside dirençli
 Cryptosporidium Kistleri: Aside dirençli
 Isospora Kistleri: Aside dirençli (zayıf boyanır)
 Nocardia spp: Aside az dirençli (zayıf boyanır)
 Rhodococcus spp: Aside az dirençli (zayıf boyanır)
 Legionella micdadei: Aside az dirençli (zayıf boyanır)

EZN boyama yöntemi 5 bilim adamının çabaları sonucu gelişmiştir:

1- Robert Koch: Tüberküloz basilini sıcak alkali metilen mavisi solüsyonunda 24 saat bekleterek ancak boyayabilmiştir 1882.
2- Paul Ehrlich: Bazı bakterilerin asit ile bile boyayı bırakmadıklarını gördü 1882. Basilleri anilin yağını mordant ( fiksatif ) olarak kullanıp basik fuksin ile boyadıktan sonra mineral yağlarla dekolorize edip görünür hale getirdi.
3- Franz Ziehl: Anilin yağ yerine mordant ( fixatif ) olarak karbonik asit kullandı 1882.
4- Rindfleisch: Sıcak boya kullanmak yerine boyayı lam üzerine koyup lamı ısıtarak zamanı kısaltmıştır 1882.
5- Neelsen: Bazik fuksin ve karbonik asit yöntemlerini birleştirerek tek metod oluşturmuştur 1883.

Mycobakteriler lipidden zengin hücre duvarları nedeniyle gram boyama gibi normal boyama yöntemleri ile çok zor boyanırlar. EZN boyamada Karbo Fuksin gibi fenollü boyalar lipid tabakayı geçebildiklerinden ilk boya olarak kullanıldılar. Karbo fuksin ile boyarken örnek ısıtılırsa lipit tabaka ( mumsu – waxy tabaka ) gevşer ve boyanın içeri nüfuz etmesi, hücre duvarına ulaşması sağlanır. Asit alkol karışımı ile örnek yıkanınca normal hücrelerin hepsi boyayı bırakır ancak Aside dirençli bakteriler boyayı bırakmazlar, boya lipid tabakanın altına geçmiştir ve lipid asit ve alkole dirençli olduğundan içerideki boyaya ulaşamaz yani aside dirençlidirler, dekolorize olmazlar, boyayı bırakmazlar.
Bakteriler bu özelliğe göre 2 guruba ayrılırlar: aside dirençli bakteriler ( boyayı bırakmayarak bu şekilde boyanabilenler) ve diğerleri olarak. Dekolorizasyon dan sonra boyanan bakterilerin kolay görülebilmesi için zeminin boyaması gerekir çünkü bu bakteriler çok çok az boya tuttuğundan parlak zeminde görülmeleri zordur. Bu amaçla metilen mavisi yada malaşit yeşili kullanılır. Bu sayede kontrast renkler oluşturularak boyanmış kırmızı acid fast organizmalar görünür hale gelir.

EZN boyamak için gerekenler:

1- Karbo Fuksin: Primer boya (yani ilk boya), 0,3% Karbo Fuksin (kahverengi şişede saklanmalıdır. 1 yıl stabil kalır)

Hazırlanışı:
1. Yöntem
50 gr fenol havanda ezilir, 100 ml %90 etanol ( yada %95 metanol) içerisinde eritilir, üzerine 3 gr bazik fuksin eklenerek karıştırılır, distile su ile 1 lt tamamlanır. filtre kağıdından süzülerek kahverengi şişeye alınır.
2. Yöntem
Basik fuksin 2,5 grm, Distile su 250 ml,  Alkol %100 25 ml, Fenol kristal 12,5 grm karıştırılarak da yapılabilir.

2- %1 asit alkol Dekolorizasyon solüsyonu ( 1d yıl stabil kalır)

Hidroklorik asit 10 ml üzerine %70 alkol 990 ml eklenir. 

3- Metilen mavisi (Zıt boyama)

– stok solüsyonu ( 1 yıl stabil kalır)
0,7 grm metilen mavisi havanda ezilerek distile suyla karıştırılarak 50 ml ye tamamlanır.
– Metilen mavisi çalışma solüsyonu ( 2 ay stabil kalır)
Metilen mavisi stok solüsyonundan 5 ml üzerine distile su ile 50 ml ye tamamlanır.

EZN boyama prosedürü :

1- Örnek lam üstüne yayılır, kurutulur,
2- Kuruyan örnek 3-4 kez alevden geçirilerek fixe edilir,
3- Lam boya teknesine konur,
4- Üzerine karbo fuksin dökülür,
5- Lam alttan alkol alevi ile ısıtılır, kaynamamasına dikkat edilir, buhar çıkmaya başlayınca alev çekilerek ısıtma işlemi 5 dakika kadar sürdürülür.
6- Çeşmede boya akmayıncaya dek yıkanır.
7- 1% Asit alkol ile 15-20 san. bekletilir dökülür, renk akmayıncaya (yada hafif pembe olana) dek bu işlem tekrarlanır.
8- Çeşmede yıkanır,
9- Metilen mavisi dökülerek 1-2 dakika beklenir,
10- Çeşmede yıkanır,
11- Kurumaya bırakılır,
12- 100x İmmersiyon objektif ile incelenir.

Balgamda EZN sonucunu raporlama

Lam en az 300 saha bakıldıktan sonra raporlanmalıdır.
100x immersiyon ile
• 300 sahada hiç ARB görülmez ise ……>ARB görülmedi
• 300 sahada 1-2 arb görüldü ise ………..>Şüpheli, örnek tekrarı önerilir,
• 100 sahada 1-9 ARB görülür ise              ARB 1+
• 10 sahada 1-9 ARB görülür ise                 ARB 2+
• Her sahada 1-9 ARB görülür ise              ARB 3+
• Her sahada 9 dan fazla ARB görülür ise ARB4+ olarak raporlanmalıdır.

Balgam da ARB negatif demek için ardışık olmayan günlerde sabah alınan en az üç örnek görmek gereklidir.
ARB negatif diye raporlanmaz; eğer 300 sahada görülmedi ise ARB görülmedi diye raporlanmalıdır.