MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI TEST ÇALIŞMA TALİMATI
AMAÇ:
Mikrobiyoloji testleri çalışma yöntemlerini, analiz öncesi hazırlıklarını, bazı testlerin çalışma yöntemlerini tarifler.
SORUMLULAR:
Laboratuvar çalışanları
TALİMATLAR:
Boğaz Sürüntüsü: Koyun Kanlı agar (Öze son sahaya 10- 15 kez batırılacak) bu alana bacitracin (A) diski koy GABHS ürer ise öze batırılan alanlarda beta hemoliz görülür hassas olduğunan disk etrafında beta hemoliz görülmez.
| İdrar | Kanlı-EMB-Direk Mikroskobi |
| Kan | KA+EMB+Çukulata+ Direkt Mikroskopi |
| Diğer Steril Vücut Sıvıları | KA+EMB+Çukulata+Sabouraud+Direkt Mikroskopi |
| Yara | KA+EMB+Çukulata+ Direkt Mikroskopi |
| Apse | KA+EMB+Çukulata+ Direkt Mikroskopi |
| Balgam | KA+EMB+Çukulata+ Sabouraud+Direkt Mikroskopi |
| Dışkı | KA+EMB+SS+GN buyyon (Ertesi sabah EMB+SS pasaj) |
| Sulu ve/veya kanlı dışkı | KA+EMB+SS+GN buyyon (Ertesi sabah EMB+SS pasaj) Ampisilinli Kanlı Agar+Kampilobakter besiyeri(mikro aerofil ortam) Sorbitollü MacConcey AGAR |
| Kolera ön tanılı dışkı | APS, Direkt mikroskopide vibrio aranılacak |
| Cx Sürüntüsü | KA+EMB/Thayer-Martin+EMB+Sabouraud+Direkt Mikroskopi |
| Meni, prostat mayi | KA+EMB+Çukulata+ Direkt Mikroskopi |
| BOS | KA+EMB+Çukulata+Sabora+Direkt Mikroskopi |
| Kulak Materyali | KA+EMB+Çukulata+ Sabouraud |
| Burundan Sürüntü | KA+EMB |
| Sinüs Aspiratı | KA+EMB+Çukulata+ Sabouraud |
| Yara, Mayi, Göz Kornea kültürleri | önce bouillon (sıvı besi yeri ) da 1 gün bekletilir. Ertesi gün Kanlı-EMB-Çikolata agara ekim yapılır. Direk preperattan yayma hazırlanır. |
| Kan kültürü | kan kültürü şişesine 10 cc kan aktarılarak hazırlanır. 1 gün bekletilir, ertesi gün Kanlı-EMB- Çikolata agara ekim yapılır. |
| Anaerop kültür için materyal Protokole bakınız |
KLİNİK MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI’NDA KÜLTÜR ANTİBİYOGRAM ÇALIŞMALARINDA;
- İdrar örnekleri dışında, tüm örneklerden boyalı mikroskopik inceleme yapılmakta, bu incelemede lökosit, epitel hücresi ve bakteri varlığı araştırılmakta, değerlendirilmektedir.
- Değerlendirmede balgam örnekleri için Bartlett skorlama sistemi, yara örnekleri için ise Q skor sistemi kullanılmaktadır.
- İdrar örneklerinde üreme sayıları ‘European Manual of Clinical Microbiology’ rehber alınarak değerlendirilmektedir.
- İdrar örneklerinde üreme sayıları değerlendirme kriterlerine göre az ve/veya karışık olduğunda hastanın tam idrar tetkiki sonucu incelenerek gerektiğinde hasta örneğinin tekrarı istenebilmektedir. Bu gibi örneklerde; preanalitik hata kaynaklarından örnek alım teknikleri ile örneklerin bekletilme ve transport koşulları yeniden gözden geçirilmelidir.
Balgam için BARTLETT değerlendirmesi
| Örnekteki Nötrofil sayısı | Puan | Örnekteki Epitel Hücre Sayısı | Puan |
| <10 | 0 | 10-25 | -1 |
| 10-25 | +1 | >25 | -2 |
| >25 | +2 | – | – |
| Mukus var | +3 | – | – |
Mikroskopta X100 büyütme alanında yirmi – otuz sahadaki epitel ve nötrofil sayılarının ortalaması alınır sonuç sıfır yada eksi çıkar ise tükürük kontaminasyonudur balgam değildir örnek reddedilir.
Yara örnekleri için Q-SKORU değerlendirmesi
| Yassı epitel hücresi | 0 yok | 1-9 az | 10-24 orta | >25 çok | |
| Nötrofil sayısı | 0 | -1 | -2 | -3 | |
| 0 yok | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 |
| 1 az | +1 | 3 | 0 | 0 | 0 |
| 2 orta | +2 | 3 | 1 | 0 | 0 |
| 3 çok | +3 | 3 | 2 | 1 | 0 |
Yara kültürü için Düşük mikroskopi alanında x40 nötrofil ve epitel sayıları tablodan karşılaştırılarak toplanan sonuç birden büyük ise örnek kültür için değerlidir aksi halde reddedilir.
KÜLTÜR ÖRNEKLERİ BOYALI MİKROSKOPİK İNCELEME, HÜCRE SAYIMI, TAM İDRAR TETKİKİ GİBİ DİREKT MİKROSKOPİK TETKİKLERDEN BAĞIMSIZ OLARAK DEĞERLENDİRİLMEMEKTEDİR.
MANTAR ARANMASI VE KÜLTÜRÜ
Mantar aranması yapılırken bir lam üzerine hasta bölgedeki deriden kazıntı alınır. Üzerine %30 luk potasyum hidroksit dökülür ve lamelle kapatılır. 1 saat kadar bekletildikten sonra mikroskopta incelenir.
Mantar kültürü yapılırken yine hasta bölgedeki deriden kazıntı alınır. Sabora besi yerine ekim yapılır, ekim besi yeri içine gömülerek yapılır. 7-10 gün kadar bekletilir. Üreyen kısımdan bant yardımıyla alınır ve 1 damla fenollü pamuk mavisi damlatılmış lam üzerine yapıştırılır. Mikroskopta incelenir.
Katalaz çalışması : % 3 sulandırılmış oksijenli sudan 1 damla lam üzerine alınır. Plakta üreyen bakteriden alınıp buraya sürülür. Köpürme varsa KATALAZ (+), köpürme yoksa KATALAZ (-) olarak değerlendirilir.
Oksidaz çalışması: Bir kurutma kağıdına 1 damla sıvı oksidaz ayracı damlatılır. Bir çubuk yardımıyla üreyen bakteriden alınır ve buraya sürülür. Mor renk oluşursa oksidaz (+) ,oluşmazsa oksidaz (-) olarak değerlendirilir.
Plazma koaülaz çalışması:
LAMDA: lama 1-2 damla steril plazma damlatılır üzerine 1 öze bakteri örneği karıştırılır hafif çalkalaryarak 1 -2 dakika beklenir ağğlütinasyon varsa koagülaz + yoksa koagülaz – denir
TÜPTE: Bir tüp içine bir miktar plazma konur. Üreyen besiyerinden bakteriler steril eküvyonla toplanır. Plazma içerisinde ezilir, ağzı kapatılarak etüvde 24 saat bekletilir. Plazma pıhtılaşırsa koagülaz + yoksa koagülaz – denir.
Bu test Staphylococcus aureus un tanısında kullanılır.
BOYAMA YÖNTEMLERİ
Giemza Boyama
- Lam üzerine yayma yapılır ve preperatın kuruması beklenir (15 dk).
- Kuruyan preperat üzerine May Grünwals dökülür 2 dk beklenir. Bunun yerine etil alkol de kullanılabilir.
- Etil alkolde 15 dk bekletilir. Bu şekilde preperat fiske edilmiş olur.
- Preperat pisetle yıkanır (Su yavaş dökülmeli.)
- Giemza boya 1 e 3 oranında sulandırılarak yıkanan preperat üzerine dökülür 20 dk bekletilir.
- Preperat yıkanır ve kurumaya bırakılır.
Gram Boyama
- Lam üzerine yayma yapılır ve kuruması beklenir.
- Preperat 3 kez alevden geçirilerek tespit edilir.
- Preperatın üzerine kristal viyole dökülür 2 dk beklenir kısık suyla yıkanır.
- Lügol dökülür 2 dk beklenir kısık suyla yıkanır.
- Alkol ile yıkanır, sudan geçirilir.
- Sulandırılmış fuksin ile 20 sn bekletilir sudan geçirilir ve kurumaya bırakılır.
Sperm Boyama (Kruger Strict )
- Lam üzerine yayma yapılır ve kuruması beklenir.
- Preperat fiksatife konur 5 dk bekletilir, fiksatiften çıkarılıp 15 dk kurumaya bırakılır.
- Kuruyan preperat sudan geçirilir fazla su kurutma kağıdıyla alınır A boyasında 1,5 dk bekletilir, sudan
- geçirilir.
- Tekrar fazla suyu alınarak B boyasında 1,5 dk bekletilir, sudan geçirilir.
- Tekrar fazla suyu alınarak C boyasında bekletilir, sudan geçirilir ve kurumaya bırakılır.
**Bütün boyamalar yapılırken yıkamalar pisetle kısık su altında yapılır.
BRUCELLA TEST PROSEDÜRÜ
Tarama Yöntemi
- Tarama amacıyla 1/160 ve 1/320 dilüsyonlar önerilir.
- Eğer pozitif ise 1/320 den başlayarak titrasyon sürdürülür.
- Bütün reaktifleri kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.
- Her hasta için 2 kuyu kullanacak şekilde ayarlayın.
- Hasta serumunu bir tüpte , dilüent ile 1/40 oranında sulandırın ( 200 mikron dilüent + 5 mikron hasta serumu)
- ve 2. kuyulara 50 mikron dilüent koyun. Diğer tüpte dilüe ettiğiniz hasta serumundan 50 mikron alıp ilk kuyuya ilave edin, 50 mikron bu kuyudan alıp 2. kuyuya koyup karıştırın ve 50 mikron alıp atın.
- Her iki kuyuya da Brucella antijeni ekleyip ağızlarını kapatın.
- Etüvde 24 saat bekletin.
(Değerlendirme pozitiflik durumunda 1/160 ile başlar.)
Titrasyon Yöntemi
- Çalışılacak sayıda kuyu çıkarın.
- İlk kuyuya 100 mikron diğer kuyulara 50 mikron dilüent koyun.
- İlk kuyuya 5 mikron hasta serumu pipetleyin ve karıştırın. Bu kuyudan 50 mikron karışımı alın ve 2.kuyuya pipetleyin ve dilisyonu devam ettirin. Son kuyudan 50 mikron alıp atın.
- Bütün kuyulara 50 mikron Brucella antijeni ekleyin, ağızlarını kapatıp etüvde 24 saat bekletin.
( Değerlendirme pozitiflik durumunda 1/40 ile başlar.)
BRUCELLA TÜP AGLÜTİNASYON TESTİ ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ
- Reaktifler oda sıcaklığına getirilir.
- Bir tüpte 900 mikron SF ile 100 mikron hasta serumu karıştırılır.
- Her hasta için 5 adet cam tüp kullanılır. Tüplere 100 mikron hasta serumu konur.
- Dilüe edilen hasta serumundan 100 mikron alınır ve 1. tüpe konarak dilüsyon yapılır.
- tüpten 100 mikron alınıp atılır.
- Tüm tüplerin üzerine 100 mikron Brucella antijeni konur ve ağızları kapatılır.
- 2 saat etüvde, 22 saat oda sıcaklığında bekletilir.
( Değerlendirme pozitiflik durumunda 1/40 ile başlar. )
BRUCELLA COOMBS TESTİ
Tüp aglütinaston testinde negatif çıkan tüpler 3 kez serum fizyolojik ile yıkanır, üst kısım atılır. Üzerine coombs
antijeninden 2 damla damlatılır ve 1 saat etüvde sonrada oda sıcaklığında bekletilir. Değerlendirme yapılır.
SALMONELLA ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ
- Çalışmaya başlamadan tüm kitler oda sıcaklığına getirilir.
- Bir tüp içine 2400 mikron serum fizyolojik ve üzerine 100 mikron hasta serumu konur karıştırılır.
- Her bir antijen için (AO, AH, BO, BH, TO, TH ) 5 kuyucuk kullanılır.
- İlk kuyu boş bırakılır ve son 4 kuyuya 100 mikron SF konur. Bu işlem 6 antijen için de yapılır.
- Boş bırakılan ilk kuyuya 100 mikron dilüe edilmiş hasta serumundan konur.
- Dilüe edilen hasta serumundan 100 mikron daha alınır ve 2. kuyudan başlanarak dilüsyon yapılır, son kuyudan 100 mikron alınıp atılır.
- Bu işlem bittikten sonra salmonella antijenlerinden 100 mikron üzerlerine konur, ağızları kapatılarak 24 saat etüvde bekletilir.
( Değerlendirme pozitiflik durumunda 1/50 ile başlar. )
*Sperm yıkama testi kit prospektüsüne göre yapılır.
*Brucella Rose Bengal testi kit prospektüsüne göre yapılır.
*Streptokok grup çalışması kit prospektüsüne göre yapılır.
İNDİREK COOMBS ÇALIŞMA PROSEDÜRÜ:
- O RH (+) pozitif kan serum fizyolojik ile 3 defa yıkanır.
- Bir tüpe 50 mikron hasta serum ile 50 mikron yıkanmış eritrosit süspansiyonu konulup 1 saat 37 derecede bekletilir.
- Daha sonra oda ısısına gelmiş Anti Human serumdan 1 damla damlatılarak 1dk 2000 devirde santrifüj edilir.
- Tüp de oluşan aglütinasyona göre değerlendirme yapılır.
GSBL
Gm (-) Bakterilerde GSBL Saptanması:
a – Tarama testi:
Seftazidim(CAZ) ≤ 22 mm ve/veya Aztreonam (ATM) ≤ 27 mm
DİRENCİ İLE BİRLİKTE
Sefoksitin (FOX) duyarlılığına bakılacak.
b- Çift disk sinerji testi:
Sefotaksim(CTX) 2-3 cm ** AMC (≤ 27 mm) veya
Seftazidim (CAZ) 2-3 cm AMC veya
Azteronam (ATM) 2-3 cm AMC veya
Sefepim (FEB ) 2-3 cm AMC
*Proteus vulgaris için öift disk sinerjide disk aralıkları 4 cm olmalıdır.
**IBL salgılayan bakteriler için ; FEP-AMC kullanılmalıdır.
Gm (-) bakterilerde IBL saptanması:
- FOX 1.5-2 cm CTX
- Ve / veya
- IPM CXM veya ATM
- CTX inhibisyon zonunda kesintiye uğramış yarıçap, diğer yarıçaptan en az 4 mm küçülmüş olmalıdır.
