Laboratuvar Teknisyenleri İçin Osmotik Frajilite Testi Nasıl Yapılır ?

Bütün canlı hücreler bir elektrolit solüsyonu içerisinde yaşarlar eğer dış ortam osmotik basıncı düşerse hücre içerisine sıvı girer ve bir süre sonra hücreyi parçalar. Alyuvarların osmotik dirençleri demek giderek artan dilüsyonlardaki sıvı içerismndeki eritrositler belli bir yerde parçalanmaya başlarlar amaç  bu noktanın tespitidir.

Araç ve Gereçler: 14 adet deney tüpü (1 x 10 cm), tüp sehpası, 1 cc’lik ince dereceli pipet, % 1 ve % 0.85’lik NaCl eriyikleri, saf su, cam kalemi ve kan örneği.

Deneyin Yapılışı: 14 adet tüp kullanılır. Tüplerden biri kontrol tüpü olarak tayin edilir. Kontrol tüpüne (1 ml %1lik NaCl) + 1 damla kan katılır. Kontrol tüpünde izotonik ortam oluşturulmuş olur ve normal bir kanın da bu ortamda hemolize uğraması beklenemez. Diğer tüplerede sırasıyla

Final Kons. (%)	Distile su ml.	1%Nacl(ml)	Test tüpü
1.00	0.0	10.0	1
0.85	1.5	8.5	2
0.75	2.5	7.5	3
0.65	3.5	6.5	4
0.60	4.0	6.0	5
0.55	4.0	5.5	6
0.50	5.0	5.0	7
0.45	5.50	4.5	8
0.40	6.0	4.0	9
0.35	6.0	3.5	10
0.30	7.0	3.0	11
0.20	8.0	2.0	12
0.10	9.0	1.0	13
0.00	10.0	0.0	14

giderek artan hipotpnik ortam a katılır ve 2 saat oda ısısında bekletilir. Tüpler gün ışığına veya yazıya tutulur. hemoliz oluşup oluşmadığına bakılır

Yorumlanması:
Hemolizin başladığı tüpteki tuz eriyiği yoğunluğu minimal dayanıklılıkdır.

Osmotik Frajiliteyi etkileyen durumlar

• Eritrositerin Hacmi,
• Eritrositlerin Volümü,
• Eritrositlerin Yüzey alanı,
• Eritrosit Membran yapısı ve Permeabilitesi,
• Eritrositlerin yüzey / Volüm oranları dır.

Osmotik Frajilite Normal Değerleri:

• Hemolizin başladığı dilüzyon: 0,45-0,5 % NaCl
• hemolizin tamamlandığı dilüsyonlar 0,3 – 0,33 % NaCl dilüsyonlar dır.

Osmotik frajilitenin düştüğü frajilitenin arttığı durumlar

• Herediter Sferositoz

Ozmotik frajilitenin Düştüğü rezistansın arttığı durumlar

• Retikülositoz,
• Orak hücre
• Target cell

RETİKÜLOSİTLER

Dr. Aydoğan Lermi Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Uzmanı

Retikülositler olgunlaşmalarını henüz tamamlamamış eritrositler dir. Yani çekirdeklerini kaybetmeye başlayan genç eritrositlerdir. Çekirdekleri yoktur ancak çekirdek parçaları RNA artıkları bulunur. Retikülositler kemik iliğinde oluşur. 3-3.5 gün ilikte olgunlaştıktan sonra dolaşıma geçerler. Dolaşımda tam olgun eritrosit halini almaları 1 gün sürer.

Normalde eritrositlerin kabaca % 1’i (% 0.5-2.0) retikülosit evresindedir. Bu hücrelerin “retikülosit” olarak adlandırılma nedeni,  metilen mavisi ya da parlak krezil mavisi gibi boyalarla (supravital boyama) içlerinde bu çekirdek parçalarının grülmesidir.

Çevre kanında retikülositler

Normal eritrositlerden biraz daha büyük olan retikülositler, eritrositler gibi tam pembe değil, biraz daha mavimsi boyanırlar.

 

ANEMİLERDE RETİKÜLOSİT SAYIMININ ÖNEMİ

Retikülosit sayısı, Kemik İliği’nin anemiye yanıtını, bir diğer deyişle ilikteki eritropoetik aktiviteyi ( kan yapım hızını) gösterir. Orta derecede anemi durumlarında (Hgb <10 g/dL), ilik normal ise, eritropoetin hormonunun etkisiyle, 10 gün içinde eritrosit yapımının 2-3 kat artması beklenir. Akut kan kaybı ya da hemolizden sonra bu yanıtı retikülosit yüzdesinin artması şeklinde görürüz (retikülositoz). Oysa; örneğin demir, B₁₂ vitamini ya da folat eksikliği sonucu oluşan yapım bozukluğuna bağlı anemilerde bu yanıtı alamayız. Retikülosit sayısı ya normal ya da normalin altındadır (retikülositopeni). Yanıtın alınabilmesi için uygun anemi tedavisinin uygulanması gerekir. Tedavinin 5-7’ inci günlerinde retikülosit sayısı birden fırlamaya başlar (retikülosit krizi).

Eritropoez üzerindeki inhibisyonun ortadan kalktığı durumlarda da retikülosit sayısı artar. İlaçlara bağlı (örn hidantoin bileşikleri) saf eritroid aplazilerinde (pure red cell aplasia) sorumlu ilaç kesildikten sonra % 30-40’lara varabilen retikülosit krizi  gelişir.

 

 

RETİKÜLOSİT SAYIMI

Bir cc kan bir tüpe konur üzerine 1 damla retikülosit boyası eklenir ve periferik yayma

yapar gibi yayılır. Yaymanın düzgün şekilde yapılması önemlidir. Hastanın hemogram sonucunun bilinmesi gerekir.

Kuruyan yayma immersiyon objektifi ile incelenir. 

Önce bir alana denk düşen eritrosit sayısı bulunur. Bunun için birkaç alandaki toplam eritrositler sayılarak ortalaması alınır.  ör: 35

 Daha sonra her alana denk gelen retikülosit sayılarak tablo hazırlanır, ne kadar çok alan sayılırsa sonuç o kadar güvenilir olur:

Alandaki eritrosit sayısı	Alan sayısı	Retikülosit sayısı
35	1	1
	2	0
	3	0
	4	0
	5	2
	6	0
	7	0
	8	0
	9	0
	10	0
	11	0
	12	1
	13	0
	14	0
	15	1
	16	0
	17	0
	18	0
	19	1
	20	0

Yukarıdaki örnekte retiküloist sayısı=(100 x bulunan retikülosit sayısı )/(alan sayısı x alanda ki eritrosit sayısı)

Yukarıdaki örnekte:

Alandaki eritrosit sayısı : 35

Alan sayısı: 20

Alandaki retikülosit miktarı: 6

Retikülosit oranı= 100 x 6/ 20x 35= 600/700=0,85

 

RETİKÜLOSİT SAYISI NASIL BELİRTİLMELİDİR?

Retikülositleri saydıktan sonra, sonucu, bir düzeltme yapmadan, eritrositlerin yüzdesi olarak bildirmek yanlıştır. Örneğin % 1 retikülosit oranı 4 milyon eritrosit sayılı bir hasta için normal, 2 milyon eritrosit sayılı bir hasta içinse düşüktür. Bu nedenle retikülosit yüzdesi HCT değerine ya da eritrosit sayısına göre düzeltilmelidir.

Düzeltilmiş retikülosit yüzdesi:

Sayım sonucu elde edilen retikülosit yüzdesi hastanın HCT değerine göre aşağıdaki formülle düzeltilir. Normal HCT % 45 kabul edilir.

Düzeltilmiş retikülosit yüzdesi = Hastanın retikülosit yüzdesi x Hasta HCT ÷ Normal HCT (45)

Yukardaki örnekte hastanın HTC %32 bulunmuş ise

Düzeltilmiş retikülosit yüzdesi: 0,85 x 32 /45 = 0,6

Mutlak retikülosit sayısı:

Sayım sonucu bulunan retikülosit yüzdesi hastanın eritrosit sayısı ile oranlanır. Mutlak retikülosit sayısı µL’deki retikülosit sayısını gösterir. Normalde mutlak retikülosit sayısı 24 bin/µL ile 84 bin/µL arasındadır.

Bazı anemilerde retikülosit sayısının ikinci bir kez düzeltilmesi gerekebilir. Retikülositoz durumlarında, bir diğer deyişle, boyanmış yaymalarda polikromazinin saptandığı durumlarda retikülosit yapım indeksi hesaplanmalıdır.

 

Retikülosit yapım indeksi (RYİ):

(İng. Reticulocyte production index). Retikülositlerin dolaşıma 3-3.5 günü doldurmadan daha  erken geçtiği durumlarda ilikte yapımın gerçekten artmış olup olmadığını, ya da artmış ise ne derece artmış olduğunu saptamak için ikinci düzeltme yapılmalıdır.

Normal çalışan bir ilikte, retikülositlerin dolaşıma erken çıkması artmış eritropoetin uyarısına uygun bir yanıttır. Örn kronik hemolitik anemilerde ilik eritrosit yapımını 6, hatta 7 kata kadar artırabilir. Ancak, bazen çevreye erken çıkışta, ilik yapısındaki bütünlüğü bozan, miyelofibroz, tümör enfiltrasyonu, granülomlar gibi patolojiler sorumludur (miyeloftizik anemiler).

 

Retikülosit yapım indeksi (RYİ):

hastanın düzeltilmiş retikülosit yüzdesi, hastanın anemisinin ağırlık derecesine (HCT’ e) göre belirlenen bir düzeltme faktörüne bölünerek bulunur.  Retikülosit yapım indeksi:düzeltilmiş retikülosit yüzdesi ÷  düzeltme faktörü ( bkz tablo ) 

Düzeltme faktörü = dolaşımda retikülosit olgunlaşma süresi (gün). Aşağıdaki tabloda HCT değerlerine göre düzeltme faktörleri gösterilmiştir.

HEMATOKRİT (%)	DÜZELTME FAKTÖRÜ (gün)
45	1.0
35	1.5
25	2.0
15	2.5

Normalde RYİ 1.0 ile 2.0 arasında olmalıdır. Değerin bir birimi yoktur.

RYİ > 2.0 : İlikte eritrosit yapımının arttığını gösterir. Örn: hemoliz, akut kan kaybı.

RYİ < 1.0 : İlikte eritrosit yapımının azaldığını gösterir. Örn demir eksikliği anemisi, aplastik anemi.

 

Önemli not: yaymada polikromazinin görülmediği durumlarda RYİ’nin hesaplanması gerekmez.

 

Bizim örneğimizde

Retikülosit yüzdesi %0,85

Hematokrit %32

Düzeltilmiş retikülosit yüzdesi=0,85 x 32 ÷45 = 0,6

Retikülosit yapım indeksi: 0,6 ÷ 2 = 0,3

Sonuç: ilikte yapım düşük

 

2. örnek

Hastanın Retikülosit yüzdesi 5,

Hematokriti % 25

Düzeltilmiş retikülosit yüzdesi: 5 x 25 ÷ 45 = 2.8

Retikülosit yapım indeksi: 2.8 ÷ 2 = 1.4

Sonuç: İlikte yapım normal.